Induzione della formazione di sinapsi mediante sintesi de novo di neurotrasmettitori

Nature Communications volume 13, numero articolo: 3060 (2022) Citare questo articolo

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Una questione vitale nelle neuroscienze è come i neuroni allineano le loro strutture postsinaptiche con i siti di rilascio presinaptico. Sebbene sia noto che le proteine di adesione sinaptica contribuiscono a questo processo, il ruolo dei neurotrasmettitori rimane poco chiaro. Qui chiediamo se la biosintesi de novo e il rilascio vescicolare di un trasmettitore non canonico possano facilitare l'assemblaggio delle sue corrispondenti postsinapsi. Dimostriamo che, sia nei neuroni umani derivati da cellule staminali che nei neuroni di topo in vivo con identità puramente glutamatergica, l'espressione ectopica degli enzimi di sintesi del GABA e dei trasportatori vescicolari è sufficiente sia per produrre GABA dal glutammato ambientale che per trasmetterlo dai terminali presinaptici. Ciò consente un accumulo efficiente e un'attivazione coerente dei recettori GABAA postsinaptici e genera sinapsi GABAergiche completamente funzionali che operano in parallelo ma indipendentemente dalle loro controparti glutamatergiche. Questi risultati suggeriscono che il rilascio presinaptico di un neurotrasmettitore stesso può segnalare l'organizzazione dell'apparato postsinaptico rilevante, che potrebbe essere direttamente modificato per riprogrammare l'identità sinaptica dei neuroni.

I neuroni comunicano tra loro tramite strutture specializzate chiamate sinapsi. Il modo in cui le sinapsi stabiliscono e mantengono la propria identità rimane in gran parte poco chiaro. Secondo una teoria, le molecole di adesione cellulare sinaptica (SAM) innescano la formazione di sinapsi promuovendo le interazioni transsinaptiche tra componenti pre e postsinaptici1,2,3. A sostegno di questa ipotesi, l'espressione ectopica dei SAM può rispettivamente potenziare o indurre la sinaptogenesi sia nei neuroni che nelle cellule non neuronali4,5,6,7. Inoltre, è stato anche riportato che le delezioni genetiche individuali di alcuni SAM diminuiscono il numero di sinapsi in misura variabile, sebbene non eliminino completamente l'assemblaggio delle sinapsi8,9,10.

È interessante notare che, nonostante questi pochi casi, i modelli di knock-out costitutivo o condizionale (KO) per la stragrande maggioranza dei SAM non mostrano alcun danno su larga scala nella formazione delle sinapsi e influenzano solo la loro maturazione funzionale, che occasionalmente potrebbe portare a una successiva perdita di sinapsi nel tempo11,12,13,14,15. Inoltre, i meccanismi SAM-dipendenti devono ancora spiegare la produzione di diversi tipi di sinapsi, perché diversi SAM postsinaptici specificamente localizzati nelle sinapsi principali glutamatergiche o γ-aminobutirriche (GABA) -ergiche possono spesso interagire con comuni partner di legame presinaptico che sono simili distribuito in entrambi i tipi di sinapsi16,17,18. Pertanto, segnali cellulari alternativi diversi dai SAM potrebbero essere necessari principalmente o simultaneamente per la sinaptogenesi e l'allineamento affidabile dell'apparato sinaptico complementare.

Un secondo modello di sinaptogenesi implica che il rilascio di neurotrasmettitori possa modulare direttamente questo processo. In risposta ai vari trasmettitori prodotti nei terminali presinaptici, i loro compartimenti postsinaptici reclutano classi distinte di recettori che conferiscono proprietà funzionali alle sinapsi. Questa teoria è ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che la cancellazione dei recettori GABAA (GABAAR) può compromettere sia la morfologia che la specificità del bersaglio di un sottoinsieme di sinapsi GABAergiche19,20. Ulteriori prove per le disposizioni postsinaptiche dipendenti dal trasmettitore sono state ottenute da recenti osservazioni secondo cui diversi co-trasmettitori sintetizzati all'interno di un singolo neurone possono spesso diventare segregati in terminali presinaptici indipendenti che contattano popolazioni cellulari postsinaptiche distinte21,22,23. Inoltre, alcuni neuroni possono anche passare da un tipo di trasmettitore all'altro in modo dipendente dall'attività, il che a sua volta altera i livelli e le composizioni dei recettori corrispondenti nelle postsinapsi24,25.

Forse il caso più convincente della sinaptogenesi indotta dal trasmettitore appare da due studi fondamentali che dimostrano che la rapida fotolisi del glutammato "ingabbiato" e del GABA vicino ai rami dendritici può causare un accumulo locale di recettori postsinaptici e proteine dell'impalcatura, con conseguente formazione di sinapsi immature che possono eventualmente integrarsi in circuiti neurali esistenti26,27. Questo fenomeno è stato riprodotto con successo anche in diversi sottotipi neurali situati in varie regioni del cervello di animali di un'ampia fascia di età28,29,30. Tuttavia, non è noto (i) se tali meccanismi possano operare durante il rilascio presinaptico di neurotrasmettitori fisiologicamente rilevanti, (ii) se queste sinapsi nascenti indotte dal trasmettitore subiscono un'ulteriore maturazione morfologica e/o funzionale, (iii) se l'identità del trasmettitore di un neurone stesso potrebbe essere deliberatamente manipolato utilizzando fattori esogeni, (iv) se il cambiamento del neurotrasmettitore rilasciato possa portare direttamente alla produzione di diversi tipi di sinapsi e (v) se queste sinapsi indotte dal trasmettitore possano svilupparsi anche in vivo, specialmente negli animali vivi. Rispondere a queste domande potrebbe consentire di comprendere i principi fondamentali su come le sinapsi si formano e acquisiscono la loro identità.

10 ms) decay kinetics, as recorded from human neurons expressing indicated factor combinations. g, h Representative traces g and cumulative histogram of τ-decay h of sPSCs recorded from Ngn2-neurons co-expressing V57 factors, before (Ctrl) and after acute treatments with PTX and/or CNQX (as annotated). i–k. Cumulative probabilities (left) and average values (right) of sPSC half-width (i), amplitude (j), and event frequency (k), measured in the absence (Ctrl) or presence of inhibitors, PTX, CNQX, or both PTX + CNQX. All data are presented as means ± SEM, with number of cells patched / independent batches. Individual data-points are provided as color-matched open circles. For panels e, f, statistical significance was evaluated by Kruskal-Wallis test paired with post-hoc nonparametric Mann-Whitney U-test using Bonferroni correction (see Source Data). For i, j, k, Skewness and Kurtosis values (-2 >≈ and ≈ < 2) suggested normal distribution, as statistical significance was weighed by two-tailed, unpaired, Student's t-test, with ***P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; ns = not significant, P > 0.05. Multiple groups in panel k were also compared by an analysis of variance (one-way ANOVA) paired with post-hoc Tukey-Kramer test, and corresponding P-values were reported./p> = 3 consecutive presynaptic pulses, as recorded from indicated conditions. j Example traces (left) of EPSCs and IPSCs evoked by train of pulses (arrows); Insets are successive paired stimulations of presynaptic inputs with ∆t = 50 ms, presented as superimposed trials (6 consecutive paired-pulses, light shades) with average traces (dark shades). All PSC amplitudes normalized to corresponding 1st pulse (right). Both EPSCs and IPSCs manifested significant synaptic depression, but of a different magnitude possibly due to different extents of desensitization and/or saturation of postsynaptic AMPARs vs. GABAARs, and therefore, could not be directly compared as a proxy for presynaptic release probabilities. All numerical data are means ± SEM, with total number of neurons recorded/experimental batches, and data-points plotted as open circles. Statistical significances were evaluated either by two-tailed, unpaired, Student's t-test (Skewness and Kurtosis values −2 > ≈ and ≈ < 2), or two-sided, nonparametric Mann-Whitney U-test, for ***P < 0.005; *P < 0.05; ns = not significant, P > 0.05. Multiple groups were compared by one-way ANOVA (i, with P-value)./p>≈ and ≈ < 2), or two-sided, nonparametric Mann-Whitney U-test (Source Data), with ***P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; ns = not significant, P > 0.05./p>≈ and ≈ < 2). Hence, statistical significance was primarily assessed by two-tailed, unpaired, Student's t-test, with ***P < 0.005; *P < 0.05; ns = not significant, P > 0.05. Multiple groups (b and c) were compared by Kruskal-Wallis test paired with post-hoc nonparametric Mann-Whitney U-test, and corresponding P-values were reported./p>≈ and ≈ < 2. Statistical significance was assessed by two-tailed, paired, Student's t-test, with ***P < 0.005; *P < 0.05; ND = events not detected./p> 0.05./p>

= 3 biological replicates were used, and sample sizes were selected so that SEM ≈ < 1/10th of their respective means for most datasets. Except Figs. 3 and 5, investigators were not blinded to allocation during experiments or outcome assessments, because many assays required prior knowledge of drug identity during acute applications (Figs. 1, 2, 6, and 7), transgene combinations (Figs. 1 and 7), or sample collections and processing at specific time-intervals (Fig. 4)./p> ≈ and ≈ < 2), statistical evaluations between conditions were conducted using unpaired (paired for batchwise comparisons), two-tailed, Student's t-test (***P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; ns = not significant, P > 0.05); otherwise, two-sided, nonparametric Mann–Whitney U-test was performed as mentioned in the corresponding figure legends. For all groupwise assessments, the P-values of single-factor ANOVA (for near-normal data distribution) or Kruskal–Wallis test (for considerable deviations from normal distribution) were reported./p>