Topi privi di PSD | Gruppo di cavi patch Jilin

Scientific Reports volume 5, numero articolo: 16410 (2015) Citare questo articolo

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L’ubiquitinazione delle proteine ha un’influenza significativa su diversi aspetti dello sviluppo e della funzione neuronale. Dorfin, noto anche come Rnf19a, è un'ubiquitina ligasi E3 del dito RING implicata nella sclerosi laterale amiotrofica e nel morbo di Parkinson, ma le sue funzioni in vivo non sono state esplorate. Riportiamo qui che Dorfin è un nuovo partner legante della proteina di impalcatura postsinaptica eccitatoria PSD-95. I topi Dorfin-mutanti (Dorfin−/−) mostrano una ridotta neurogenesi adulta e un potenziamento a lungo termine potenziato nel giro dentato dell'ippocampo, ma un normale potenziamento a lungo termine nella regione CA1. Dal punto di vista comportamentale, i topi Dorfin−/− mostrano un condizionamento alla paura contestuale compromesso, ma livelli normali di condizionamento alla paura, estinzione della paura, apprendimento e memoria spaziale, memoria di riconoscimento degli oggetti, memoria di lavoro spaziale e separazione dei modelli. Utilizzando un approccio proteomico, identifichiamo anche un numero di proteine i cui livelli di ubiquitinazione sono diminuiti nel cervello Dorfin−/−. Questi risultati suggeriscono che Dorfin può regolare la neurogenesi adulta, la plasticità sinaptica e la memoria della paura contestuale.

L’ubiquitinazione delle proteine regola diversi aspetti dello sviluppo e della funzione neuronale. Le ubiquitina ligasi E3, che si contano a centinaia (~ 400-500 nei topi e nell'uomo), sono componenti chiave del sistema di ubiquitinazione delle proteine, svolgendo un ruolo importante nel determinare la specificità del substrato. È noto che l'ubiquitinazione delle proteine porta alla degradazione delle proteine da parte del proteasoma 26S; tuttavia, le prove accumulate indicano che svolge anche funzioni aggiuntive, come la regolazione della funzione proteica, il traffico e la localizzazione subcellulare, nonché le interazioni proteina-proteina.

L'ubiquitinazione delle proteine nel sistema nervoso regola diversi stadi dello sviluppo neuronale, tra cui neurogenesi, migrazione, neuritogenesi e sinaptogenesi1,2,3,4,5. Inoltre, si ritiene che l'ubiquitinazione delle proteine sinaptiche regoli diversi aspetti della struttura, della funzione e della plasticità sinaptica. I substrati noti dell'ubiquitinazione sinaptica includono proteine di impalcatura/adattatore, recettori e molecole di segnalazione. Esempi specifici e relative ligasi E3 includono PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, liprin-α1–APC/C13,14 , efexina-5–Ube3A15, Arc–Ube3a/Triad3a16,17, recettori AMPA (AMPAR)–Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, recettori NMDA (NMDAR)–Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, recettori GABAA (subunità γ2)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 e Piccolo/Fassoon–Siah1A30.

Dorfin, un'ubiquitina ligasi E3 del dito RING, è stata originariamente identificata come un componente del corpo XY degli spermatociti e dei centrosomi31. Dorfin (840 aminoacidi lunghi nei topi) contiene due domini RING che fiancheggiano il dominio dell'anello intermedio (IBR) e due domini transmembrana, sebbene la precisa topologia della membrana della proteina non sia ben stabilita. Precedenti studi hanno implicato Dorfin nella sclerosi laterale amiotrofica familiare (SLA) e nel morbo di Parkinson32,33,34,35,36,37,38,39,40. A sostegno del ruolo neuroprotettivo di Dorfin nella SLA, Dorfin ubiquitina la proteina mutante SOD1 (superossido dismutasi 1) associata alla SLA33 e, quando sovraespressa in un modello murino di SLA familiare, riduce la quantità di proteine SOD1 mutanti e sopprime i fenotipi neurologici e motori morte neuronale40. Tuttavia, si sa poco sulle funzioni di Dorfin nel cervello normale, comprese le sue interazioni proteina-proteina, le proteine substrato e le conseguenze funzionali dell'ubiquitinazione delle proteine substrato. Inoltre, le funzioni in vivo di Dorfin non sono state esplorate utilizzando approcci di eliminazione genetica.

Nel presente studio, abbiamo scoperto che Dorfin interagisce con l'abbondante proteina di impalcatura postsinaptica eccitatoria PSD-95. I topi Dorfin−/− mostrano una neurogenesi adulta soppressa e un potenziamento a lungo termine (LTP) potenziato nel giro dentato (DG) e un alterato condizionamento della paura contestuale, suggerendo che Dorfin è importante per la neurogenesi adulta, la plasticità sinaptica, l'apprendimento e la memoria.

60%; ++, 30–60%;, +, 10–30%; −, no significant growth. (C) Pull down of full-length PSD-95 family proteins and control PDZ proteins (S-SCAM and GRIP2) by GST-Dorfin fusion proteins. GST-Dorfin (aa 834–840; WT and I840A), or GST alone, was used to bring down the indicated proteins expressed in HEK293T cells, followed by immunoblotting. (D,E) Coimmunoprecipitation of Dorfin with PSD-95 or SAP97. HEK293T cells doubly transfected with Flag-Dorfin (full length; WT or Δ3 missing the last three aa residues) and PSD-95, or SAP97, were immunoprecipitated (IP) with Flag antibodies and immunoblotted with the indicated antibodies./p>2.5 folds in the Dorfin−/− hippocampus relative to WT controls (see also Supplementary Table 1). Green circles indicate the proteins whose expression levels were tested by immunoblot of hippocampal lysates (see also Fig. 7H). (C–G) Dorfin forms a complex with five selected proteins from the list in Fig. 7B. HEK293 cells doubly expressing Myc-Dorfin and the indicated proteins were immunoprecipitated and immunoblotted with Myc or EGFP antibodies. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) and H2AFZ (G). Input, 5%. (H) Protein expression levels in the Dorfin−/− hippocampus (2–3 months) relative to those in WT controls, as determined by the immunoblot analysis of whole hippocampal lysates, the crude synaptosomal (P2) hippocampal fraction and microdissected whole DG lysates. (s.e.m., n = 3–6 for WT and KO hippocampi)./p>2.5 fold) in the Dorfin−/− brain relative to WT controls (Supplemental Table S1). These proteins could be classified into several functional groups, including adhesion molecules/extracellular matrix, adaptor/scaffolds, G protein-related proteins, phosphatases, proteases, enzymes and cell cycle/chromatin regulatory proteins (Fig. 7B)./p>2.5-fold in Dorfin−/− mice might provide some starting points. Indeed, many of these proteins are enriched in the postsynaptic density (PSD) and have been implicated in the regulation of excitatory synaptic transmission, synaptic plasticity and learning and memory (Supplemental Table S1). For example, Rab11a/b promotes translocation of recycling endosomes into dendritic spines and local exocytosis of GluA1 during LTP74,75,76,77. Therefore, Dorfin-dependent ubiquitination and degradation of Rab11a/b proteins would negatively regulate LTP. In addition, transgenic mice in which the signaling adaptors 14-3-3η and 14-3-3ζ are functionally inhibited by genetic expression of an inhibitor protein display reductions in synaptic content of NMDARs, NMDAR-mediated synaptic transmission, LTP and contextual fear conditioning78, suggesting that 14-3-3η and 14-3-3ζ positively regulate synaptic plasticity and learning and memory. Therefore, these functions may be suppressed by Dorfin-dependent 14-3-3 protein degradation./p>